Die Biogenese von Chlorophyll-a/b-bindenden Lichtsammelkomplexen : Topographie des Apoproteins bei der Thylakoidinsertion

Die Biogenese von Chlorophyll-a/b-bindenden Lichtsammelkomplexen: Topographie des Apoproteins bei der Thylakoidinsertion Der wichtigste Chlorophyll a/b-bindende Lichtsammelkomplex höherer Pflanzen ist der an Photosystem II assoziierte LHCII. Die kerncodierten Apoproteine dieses Pigment-Protein Komplexes werden posttranslational in den Chloroplasten importiert und mit Hilfe des plastidären

Beziehungen zwischen den Xanthophyllzyklen und der Biosynthese von Lichtsammelxanthophyllen in Chlorophyll a/c-haltigen Algen

Zusammenfassung:In Chlorophyll(Chl) a/c-haltigen Algen leisten Xanthophylle einen wesentlichen Beitrag zur Lichtsammlung. Daneben finden sich weitere Xanthophylle, die an einem Schutzmechanismus bei überoptimalem Lichtangebot beteiligt sind, dem sog. Xanthophyllzyklus. Ein Teil der Chl a/c-haltigen Algen besitzt den auch bei Höheren Pflanzen anzutreffenden Violaxanthin/Antheraxanthin/Zeaxanthin-(Vx/Ax/Zx-)Zyklus. In anderen Gruppen wie den Dinophyta, Haptophyta und den Kieselalgen (Bacillariophyceae) ist statt dessen der Diadinoxanthin/Diatoxanthin-(Ddx/Dtx-)Zyklus zu finden. Die vorliegende Arbeit zeigt, daß schwachlichtadaptierte Turbidostatkulturen der Kieselalge Phaeodactylum tricornutum unter mehrstündiger Starklichtinkubation neben den Pigmenten des Ddx/Dtx-Zyklus auch die des Vx/Ax/Zx-Zyklus akkumulieren. Außerdem läßt sich ein dritter Xanthophyllzyklus zwischen beta-Cryptoxanthin (Cx) und beta-Cryptoxanthin-Epoxid (CxE) nachweisen, doch liegen diese beiden Pigmente nur in sehr geringen Konzentrationen vor. Für die Starklichtakkumulation von Zx ist eine hohe Deepoxidase-Aktivität und die de-novo-Synthese von Carotinoiden erforderlich. Aus Zx wird im anschließenden Schwachlicht über die Intermediate Vx und Ddx das Lichtsammelxanthophyll Fucoxanthin (Fx) synthetisiert. Dies bestätigt auch ein Vergleich der Kinetiken der einzelnen Umwandlungsschritte mit den anhand eines Modells der Xanthophyllbiosynthesewege ermittelten theoretischen Ratenkonstanten. Dieser Vergleich legt jedoch nahe, daß bei der Vx-Synthese aus beta-Carotin CxE anstelle von Zx involviert sein könnte. Eine Untersuchung weiterer Chl a/c-haltiger Algen mit Ddx/Dt-Zyklus ergab, daß sie unter Starklicht ebenfalls den Vx/Ax/Zx-Zyklus akkumulieren. Weiterhin sind, mit Einschränkungen bei den Dinophyten und Xanthophyceen, alle untersuchten Algen in der Lage, die unter Starklicht akkumulierten Xanthophyllzykluspigmente im nachfolgenden Schwachlicht zur Synthese des jeweiligen Lichtsammelxanthophylls zu nutzen. Unter energetischen Gesichtspunkten stellt dieses Pigment-Recycling insbesondere für die Fx-haltigen Algen einen Vorteil dar, da ihre Lichtsammelkomplexe im Vergleich zu denen der Höheren Pflanzen etwa die doppelte Anzahl an Xanthophyllen binden.

Pigmentbindung verschiedener Mitglieder der erweiterten Chlorophyll a/b-Proteinfamilie und des wasserlöslichen Chlorophyll-Proteins WSCP

In dieser Arbeit wurde die Pigmentbindung verschiedener Pflanzenproteine untersucht, um daraus Rückschlüsse auf ihre Funktion zu ziehen. PsbS, die S-Untereinheit des Photosystems II, konnte mit Pigmenten isoliert werden. Es wurde kein Hinweis auf eine spezifische Wechselwirkung der Chromophore gefunden, Ergebnisse wie pigmentabhängig stärkere Helixbildung unterstützen jedoch die Vermutung, PsbS fungiere als transienter Pigmentcarrier. Die Sequenzverwandten OHP, Sep1 und Sep2 binden entweder keine Pigmente oder nur so schwach, dass eine Bindung mit den verwendeten Methoden nicht nachweisbar ist.WSCP aus Blumenkohl ist ein wasserlösliches chlorophyllbindendes Protein mit unbekannter Funktion. In dieser Arbeit wurde ein rekombinantes WSCP mit N-terminal angehängtem His-Tag hergestellt und überexprimiert. WSCP-his tetramerisiert pigmentabhängig und bindet Chlorophylle, nicht aber Carotinoide. In seinen biochemischen und spektroskopischen Eigenschaften gleicht das rekombinante dem nativen WSCP und kann als Werkzeug für Untersuchungen zur Funktion herangezogen werden. Rekonstitutionsexperimente mit Chlorophyll-Derivaten zeigten, dass der Phytolrest für die Oligomerisierung des Proteins verantwortlich ist. WSCP bindet außerdem die Chlorophyll-Vorstufen Chlorophyllid und Mg-Protoporphyrin IX. Es könnte sich um ein Carrierprotein handeln, welches die Vorstufen von der Chloroplastenhülle durch das Stroma zur Thylakoidmembran transportiert. Der Fall eines chlorophyllbindenden Pflanzenproteins ohne Carotinoide ist einmalig. Messungen zu Photostabilität und Singulettsauerstoffbildung zeigten, dass es dennoch gebundenes Chlorophyll vor photooxidativer Schädigung schützt.

Regulation der Zeaxanthin- und der Diatoxanthin-Epoxidase in Chlorophyll a/b- und Fucoxanthin-Chlorophyll a/c-haltigen Pflanzen

In der vorliegenden Arbeit wird der Vx-Zyklus und der Ddx-Zyklus unterschiedlicher Pflanzen hinsichtlich ihrer Regulation untersucht. Es konnte an Hand von in vivo Messungen gezeigt werden, dass bei zwei Kieselalgen unterschiedlicher Ordnung (Pennales bzw. Centrales) und einer Haptophyte mit Ddx-Zyklus die Dtx-Epoxidase delta-pH-reguliert ist. Im Gegensatz dazu steht die nicht-regulierte Zx-Epoxidase des Vx-Zyklus einer Raphidophyceae, einer Grünalge und einer aquatischen Höheren Pflanze. Es konnte gezeigt werden, dass der Grund für diese unterschiedliche Regulation der beiden Epoxidasen die verschiedenen Quench-Eigenschaften der Pigmente Dtx bzw. Zx ist. Durch parallele Messungen des NPQ und des De-Epoxidierungsgrads wurde deutlich, dass Zx zum Aufbau eines Quenching direkt den im Licht aufgebauten delta-pH benötigt, während Dtx alleine ausreichend ist, um ein Quenching zu verursachen. Bei diesen in vivo Messungen wurde außerdem deutlich, dass die Aktivitäten der untersuchten Epoxidasen große Unterschiede aufweisen. Diese sind abhängig von der entsprechenden Pigmentierung des jeweiligen Lichtsammelsystems, stehen also in Zusammenhang mit den Carotinoidbiosynthesen. Es konnte gezeigt werden, dass bei allen untersuchten Organismen, die eine Xanthophyll-dominierte Antenne mit Fx als Massenpigment enthielten, die Umsatzraten der Epoxidase sehr hoch waren, im Gegensatz zu Chl-dominierten Antennen. Nach diesen Erkenntnissen wurde die Dtx-Epoxidase weiter untersucht und so erstmalig durch Western-Blotting identifiziert. Es ergaben sich, allerdings erst nach zusätzlicher Proteinstabilisierung, zwei Signale, eins bei 60 kDa, das andere bei 57 kDa. Hierbei ist nach wie vor unklar, warum das Antiserum zwei Signale lieferte und ob es sich dabei um Isoformen, um anderweitige Modifizierungen, oder um eine Kreuzreaktion handelt. Auch der Mechanismus der delta-pH-Regulation der Dtx-Epoxidase konnte trotz in vivo und in vitro durchgeführter Studien nicht endgültig geklärt werden. Allerdings konnten verschiedene Mechanismen, wie z.B. eine direkte pH-Abhängigkeit des Enzyms, eine Regulation durch Reduktion und Oxidation oder durch Phosphorylierung und Dephosphorylierung, auf Grund der Daten falsifiziert werden. Es konnte schließlich die Regulation mit Hilfe eines transmembranen Rezeptors als das einzige, mit allen Daten konsistente Regulationsmodell vorgeschlagen werden.

Einzelmolekülspektroskopische Studien an Farbstoff-markierten Chlorophyll-a/b-Lichtsammlerkomplexen und Untersuchungen zur Integration der Komplexe in elektrochemische Solarzellen

Die zentrale Funktion des Hauptlichtsammlerkomplexes des Photosystems II, LHCII, besteht in der Absorption von Sonnenlicht und der Bereitstellung von Energie für die photosynthetische Ladungstrennung im Reaktionszentrum des Photosystems. Auch in der Regulation der Photosynthese spielt der LHCII eine wichtige Rolle, da die Energieverteilung zwischen Photosystem I und Photosystem II im Rahmen des sog. „State Transition“-Prozesses über die Verteilung der Lichtsammlerkomplexe zwischen den beiden Photosystemen gesteuert wird. Im Blickfeld des ersten Teils dieser Arbeit stand die konformative Dynamik der N-terminalen Domäne des LHCII, die wahrscheinlich in die Regulation der Lichtsammlung involviert ist. Gemeinsam mit Mitarbeitern des 3. Physikalischen Instituts der Universität Stuttgart wurde an der Etablierung einer Methode zur einzelmolekülspektroskopischen Untersuchung der Dynamik des N-Terminus gearbeitet. Als Messgröße diente der Energietransfer zwischen einem Fluoreszenzfarbstoff, der an die N-terminale Domäne gekoppelt war, und den Chlorophyllen des Komplexes. Die Funktion des LHCII als effiziente Lichtantenne bildete die Grundlage für den zweiten Teil dieser Arbeit. Hier wurde untersucht, in wie weit LHCII als Lichtsammler in eine elektrochemische Solarzelle integriert werden kann. In der potentiellen Solarzelle sollte die Anregungsenergie des LHCII auf Akzeptorfarbstoffe übertragen werden, die in der Folge Elektronen in das Leitungsband einer aus Titandioxid oder Zinndioxid bestehenden porösen Halbleiterelektrode injizierten, auf der Komplexe und Farbstoffe immobilisiert waren.

Das wasserlösliche Chlorophyll-Protein (WSCP): biochemische Charakterisierung und Untersuchungen zur biologischen Funktion

Das WSCP (water-soluble chlorophyll protein) der Brassicaceen ist das einzig bekannte Chlorophyll-bindende Protein, welches keine Carotinoide bindet. Es ist ein wasserlösliches, ca. 80 kDa großes Homotetramer mit 1-4 gebundenen Chlorophyllen. Das Protein ist äußerst stabil und vermag die gebundenen Chlorophylle vor Photooxidation zu schützen. Seine Funktion in der Pflanze ist bis heute ein Rätsel und sollte in dieser Arbeit zusammen mit seinen biochemischen Eigenschaften weiter aufgeklärt werden. Es wurden Versuche durchgeführt mit nativem und rekombinantem WSCP aus Blumenkohl (BoWSCP bzw. BoWSCPhis) und aus Arabidopsis thaliana (AtWSCP bzw. AtWSCPhis). Die Expressionsausbeute von BoWSCPhis konnte verbessert werden und zusätzlich wurde die Rekonstitutionsmethode für das rekombinante WSCP optimiert, sodass das pigmentierte Protein mit hoher Ausbeute und großer Reinheit gewonnen werden konnte. Zudem wurde ein neuer WSCP-Klon hergestellt, mBoWSCPhis, der in seiner Sequenz dem maturen nativen BoWSCP entspricht und weitaus weniger Aggregationsprobleme zeigte als BoWSCPhis. Weiterführende Versuche zur Stabilität und dem Oligomerisierungsgrad von WSCP haben die neue Erkenntnis erbracht, dass die Phytolschwänze der von WSCP gebundenen Chlorophylle zwar essentiell sind für die Stabilität von WSCP-Oligomeren, nicht aber für die Oligomerisierung selbst, wie es in der Literatur bislang postuliert wurde. Zusätzlich zu ihrer außerordentlichen Hitzestabilität erwiesen sich die Chl-WSCP-Komplexe als stabil in einem breiten pH-Spektrum. AtWSCPhis besaß eine vergleichbare Stabilität, und auch das Oligomerisierungsverhalten zeigte Ähnlichkeiten zu BoWSCPhis. Im Rahmen einer Forschungskooperation mit dem Institut für Optik und Atomare Physik der TU Berlin wurden zeitaufgelöste Absorptionsspektren sowie Tieftemperatur-Fluoreszenzspektren an Chl-WSCP-Komplexen gemessen. Die Ergebnisse zeigten deutlich, dass die WSCP-gebundenen Chlorophylle excitonisch gekoppelt sind und wiesen zudem auf unterschiedliche Chl-Bindungsmodi hin. Aufgrund seines einfachen Aufbaus und seines geringen Chlorophyllgehalts hat sich WSCP bei diesen Versuchen als sehr geeignetes Modellsystem erwiesen, um Messungen zur Chlorophyllbindung mit Vorhersagen aus theoretischen Modellen zu vergleichen. Bei den Experimenten zur biologischen Funktion wurden einerseits Arabidopsis thaliana WSCP-„knock-out“-Pflanzen unter verschiedenen Bedingungen charakterisiert, andererseits wurden Experimente mit rekombinantem WSCP durchgeführt, um eine mögliche Interaktion mit anderen Proteinen zu detektieren. Die vegetativen Stadien der Mutante zeigten keinen Phänotyp; das native Arabidopsis-WSCP konnte später bei der Wildtyp-Pflanze ausschließlich in jungen Schoten lokalisiert werden, was eine Erklärung hierfür lieferte. Rekombinantes WSCP konnte Chlorophylle aus nativem LHCII entfernen, eine Interaktion mit Chlorophyllase konnte jedoch nicht nachgewiesen werden; daher konnte auch die Hypothese, WSCP sei ein Chl-Carrier beim Chl-Abbau, nicht untermauert werden. Bei den durchgeführten Enzym-Assays wurde eine geringfügige Inhibition der Cysteinprotease Papain beobachtet, aber keine Inhibition der Serinprotease Trypsin, obwohl Blumenkohl-WSCP N-proximal das Motiv der Künitz-Proteaseinhibitoren besitzt. Die Frage nach der biologischen Funktion von WSCP bleibt also weiterhin offen.